23. Генная терапия

Панайотис Василопулос, Бланка Флорес-Санчес, Линдон да Круз

Генная терапия предполагает использование вирусных векторов для переноса терапевтических генов в клетки-мишени. Эти векторы доставляются в растворе высокой концентрации, который вводится в непосредственной близости от ткани-мишени. В настоящее время лечение направлено в первую очередь на коррекцию патологического происхождения заболеваний, имеющих генетическую основу, и многие такие заболевания сетчатки проходят клинические испытания.

Мишени для генной терапии сетчатки

Аденоассоциированный вирус (AAV) 2-RPE65 (LUXTURNA→) используется для лечения врождённого амавроза Лебера, связанного с дефектами гена RPE65 (LCA-RPE65); он стал первым продуктом генной терапии, получившим одобрение на продажу в США и Европе. Белок RPE65 активен в пигментном эпителии сетчатки (RPE) и участвует в зрительном цикле. Было доказано, что замена RPE65 с помощью аденоассоциированного вируса безопасна и улучшает зрение у пациентов, страдающих от этих заболеваний.

Хориоидеремия — это наследуемое по Х-сцепленному типу заболевание сетчатки, вызванное мутациями в гене CHM. В настоящее время проводятся клинические испытания генной терапии, в ходе которых оценивается безопасность и эффективность субретинального введения AAV2-REP1, которое направлено на предотвращение прогрессирования заболевания путём восстановления внутриклеточного транспорта и функций пренильной активности белка-эскорта Rab 1 (REP1).

Х-сцепленный пигментный ретинит (ПП) обычно вызывается мутациями в гене, кодирующем белок-регулятор ГТФазы (RPGR), что приводит к прогрессирующей дегенерации палочек и колбочек. Последние достижения в области доставки функционального гена RPGR с помощью AAV привели к одобрению трех методов генной терапии на основе AAV, которые в настоящее время находятся на ранних стадиях клинических испытаний и являются наиболее перспективными методами лечения.

Помимо моногенных заболеваний, мишенями для генной терапии стали распространённые приобретённые заболевания сетчатки, такие как возрастная макулярная дегенерация (ВМД). При таких заболеваниях генная терапия направлена не на исправление генетической мутации, вызывающей заболевание, а на воздействие на гены, которые, как известно, участвуют в патологических процессах, таких как неоваскуляризация. Подходы к генной терапии при таких заболеваниях менее развиты, чем при наследственных заболеваниях сетчатки. Тем не менее, несколько компаний в настоящее время находятся на первой или доклинической стадии оценки кандидатов в генные препараты для лечения как влажной, так и сухой ВМД. Другие патологические процессы, такие как воспаление и рубцевание, также являются потенциальными целями для генной терапии в будущем.

Терапевтические стратегии генной терапии

Эта цель достигается за счет:

• Восстановление недостающего гена и, следовательно, функции белка, нарушенной в результате мутаций в генах клеток-мишеней, используется при рецессивных и Х-сцепленных заболеваниях
• Подавление экспрессии дефектного гена – при доминирующих заболеваниях
• Стимулирование выработки белка для лечения основного заболевания (например, нейропротекции)

Типы доступных векторов

Модифицированные вирусные векторы в настоящее время являются лучшим способом доставки или модуляции генов в клетки-мишени различных тканей глаза с очень высокой эффективностью. Их можно сконструировать таким образом, чтобы они избирательно заражали или экспрессировались в определённых клетках-мишенях.

Основные векторы, подходящие для клеток сетчатки, получены из:

1. Аденоассоциированные вирусно — AAV векторы имеют то преимущество, что являются единственными векторами, которые могут эффективно трансдуцировать как фоторецепторы, так и RPE после субретинальной инъекции. Они обладают относительно низкой иммуногенностью и хорошо переносятся в глазу. AAV-векторы не интегрируются в геном хозяина, персистируя преимущественно в ядрах клеток-мишеней. Основным ограничением AAV является его небольшой размер и, следовательно, ограниченная способность с точки зрения размера гена
2. Лентивирус (LV) обладает более высокой способностью к репликации, но встраивается в геном, что повышает риск возможной случайной интеграции в геном хозяина и канцерогенеза. Основным недостатком, ограничивающим использование LV, является низкая скорость трансдукции зрелых фоторецепторов
3. Аденовирус (Ad) — векторы на основе человеческого аденовируса были первыми, которые оценивались для переноса генов в сетчатку. Векторы Ad нацелены на RPE, но могут вызывать воспалительные и иммунные реакции, приводящие к повреждению клеток-хозяев. Они больше не используются широко в клинических испытаниях

Хирургический Способ Родоразрешения

При генной терапии сетчатки растворы вирусов, содержащие до 2,0 x 1010 копий в 100 мкл, могут вводиться в необходимое внутриглазное пространство. В настоящее время эти растворы вводятся либо в субретинальное, либо в интравитреальное пространство. Защитная иммуногенность глаза делает генную терапию более переносимой, хотя требуется иммуносупрессия, и риск возникновения вредной воспалительной реакции всё же существует, хотя и меньше, чем при системном введении вирусного вектора. Локальный подход также минимизирует необходимую дозу вектора и ограничивает его попадание в системный кровоток, тем самым снижая риск повреждения иммунной системы.

Общехирургический подход:

Комплектация — набор для витрэктомии, игла 41-го калибра/система для инъекций MEDONE, канюля VFC, интраоперационная ОКТ (предпочтительна, но не обязательна).

Шаги

1. У молодых людей предпочтительна общая анестезия, чтобы избежать нежелательных движений головы во время субретинальных родов
2. Сердцевинная витрэктомия
3. Начало отслоения задней части стекловидного тела (ОЗСТ, которое у детей с дистрофией часто проходит легче, чем у обычных детей). Используйте разбавленный триамцинолона ацетонид для подтверждения отделения задней части стекловидного тела; при необходимости используйте скальпель, иглу, гибкую петлю, пинцет или силиконовую кисточку с алмазной крошкой, если витрэктомический нож не вызывает отслоение задней части стекловидного тела. Осторожно отделите прилипшие остатки стекловидного тела от заднего полюса. (См. главу 4 «Индукция отслоения задней части стекловидного тела»)
4. По желанию: введите краситель Dual Blue для облегчения визуализации ретинотомии, если требуется повторное введение через то же или альтернативное место. Рекомендуется однократная инъекция
5. Периферическая витрэктомия и осмотр с оттяжкой для исключения разрывов сетчатки. Имейте низкий порог для лечения подозрительных периферических поражений, решёток, пучков и т. д.
6. Наполните и подготовьте канюлю VFC с помощью инжектора MedOne Surgical, Inc. MicroDose&tradem. Протестируйте систему с помощью BSS. Рассмотрите возможность скоса дистального конца канюли под углом 45 градусов
7. Если возможно: активируйте интраоперационную ОКТ и настройте параметры для получения чёткого изображения макулярной области (рис. 23.1A)
8. Образование пузырьков:
   1. Рассмотрите возможность формирования пузырька с помощью BSS перед непосредственной субретинальной инъекцией для доставки генов (необязательно, не требуется)
   2. Лучшее место для создания пузырька зависит от обстоятельств. Авторы рекомендуют сначала выполнить экстрафовеальную ретинотомию иглой 41-го калибра в надвисочной или верхней части макулы в пределах дуг (рис. 23.1B).
   3. Аккуратно введите иглу в ткань сетчатки и начните субретинальную инъекцию лекарственного средства, контролируя давление с помощью ножной педали
   4. Продолжайте расширять пузырёк, пока не отделится нужная область макулы; это может включать фовеа. Можно создать несколько пузырьков
   5. Избегайте чрезмерного растяжения сетчатки, вводя только необходимое количество раствора генного вектора (≤300 микролитров); это позволит избежать риска ятрогенных разрывов макулы. Интраоперационная ОКТ обеспечивает более безопасную доставку, позволяя напрямую визуализировать образование пузырька и немедленные изменения в слоях сетчатки
   6. Ретинотомия заживает самостоятельно и не требует ретинопексии
9. Частичный обмен жидкостью и воздухом
10. Наложите швы на все склеротомии

Рисунок 23.1 Субретинальное проведение генной терапии
A: Интраоперационный широкоугольный обзор заднего сегмента (слева) и оптической когерентной томографии макулы (справа) у 22-летнего мужчины с диагнозом «хориоидеремия» до инъекции. Витрэктомия и индукция задней отслойки стекловидного тела уже проведены.

Рисунок 23.1 Субретинальное проведение генной терапии
B: Формирование блеб: игла 41-го калибра введена в верхнюю часть макулы внутри аркады (слева) для доставки вектора генов; интраоперационная ОКТ (справа) показывает наличие субретинального раствора, вызывающего локальную субфовеальную отслойку.

Видео

Видео 23.1 Субфовеальная доставка аденовирусного вектора для генной терапии